siRNA轉染實驗步驟及實驗原理

siRNA是目前基礎研究中常用的基因沉默（基因干擾）形式之一，方便快捷，在各種真核生物的基因功能研究，藥靶發(fā)現(xiàn)及藥物篩選中廣泛應用。常規(guī)siRNA產品為凍干粉形式的即用型試劑，-20°保存。進行特異性靶點設計，覆蓋人、小鼠、大鼠全基因組的所有基因，借助化學轉染技術適合進行各種細胞RNAi實驗。此外，通過對siRNA進行特殊化學修飾，可以實現(xiàn)在體內實驗更加高效、特異、穩(wěn)定。

siRNA轉染原理

siRNA在細胞中降解mRNA的機制與miRNA類似（如上圖），合成的siRNA通過胞吞進入細胞中，隨后少量的 siRNA 能夠發(fā)生溶酶體逃逸進入細胞質，進入細胞質后siRNA與 Dicer 及 TRBP 形成 RISC復合物，RISC復合物招募 AGO2，隨后正義鏈被降解，siRNA 反義鏈與互補配對的 mRNA 序列結合，接著 AGO2 對mRNA 進行切割，最終引起 mRNA 的降解。

siRNA轉染實驗步驟（下面以 24 孔板為例，其他培養(yǎng)皿中轉染可以咨詢李記生物）

1、接種細胞

   對于貼壁細胞：轉染前一天，將細胞按照每孔1-2x10^5個細胞的量進行鋪板，使其在轉染時密度為60%-80% 為佳。

   對于懸浮細胞：轉染當天，配制轉染試劑-核酸復合物之前，用PBS清洗細胞1-2次，用250 μL Opti-MEM I 減血清培養(yǎng)基 (無血清) 重懸細胞，在24孔板中進行細胞鋪板，細胞密度為60-80%。

2、準備轉染試劑-siRNA復合物（或轉染試劑-miRNA復合物）

   (1)對于每孔細胞，取2 μLsiRNA (20 μM，DEPC水溶解)加入到1.5mL離心管中，加入2 μL轉染試劑與siRNA 混合，室溫孵育3 min。

   (2)往上述混合物中加入100 μL Opti-MEM I減血清培養(yǎng)基(無血清)，輕輕混勻，在室溫下靜置30 min，形成轉染試劑-核酸復合物。

   (3)30 min后，往上述復合物中加入250 μLOpti-MEM I減血清培養(yǎng)基(無血清)，輕輕混勻。

3、轉染細胞

   (1)細胞用PBS清洗1-2次，將上述350µL轉染試劑-siRNA復合物加入每孔細胞。

   (2)在 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24-48 h，無需更換新的培養(yǎng)液，之后即可檢測基因干擾效果或者后續(xù)功能實驗。注：可在轉染12h后補充500 μL培養(yǎng)基。

siRNA轉染效率驗證

siRNA沉默效果分析siRNA 轉染細胞后，siRNA 在  細胞內一系列酶的作用下形成RNA誘導的沉默復合物，識別并切割靶基因mRNA，誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應， 從而抑制了細胞內目的基因蛋白的表達，一般可從兩個方面進行檢測。

 • mRNA 水平 - QPCR檢測

  siRNA的作用機理在于其引起靶基因mRNA的降解，因此mRNA的降解水平是siRNA 沉默效率的直接證明。一般在siRNA轉染后24小時后即可檢測到靶mRNA水平的降低，可采用細胞總RNA提取，全長cDNA合成，熒光定量實驗即可檢測到mRNA 的敲除效率。

 • 蛋白水平 - WB檢測

  siRNA引起靶基因mRNA的降解，從而影響了靶蛋白的表達。但蛋白水平檢測時間受細胞內目的蛋白表達量、穩(wěn)定性、半衰期、甚至其他調控等因素的影響，蛋白質水平下降的幅度與mRNA水平下降不一定成線性正比關系。一般在轉染后48后開始WB檢測，72，96 小時，甚至更長時間之后多點采樣。