干貨分享 | 細胞凍存與復(fù)蘇避坑指南

　　細胞凍存和復(fù)蘇是細胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響細胞存活率和活力，關(guān)系到后續(xù)細胞實驗?zāi)芊癜凑沼媱澯行У剡M行。要想做好細胞凍存和復(fù)蘇，首先請牢記下面這四個字：
 

　　慢凍快融！
 

　　1、為什么要慢凍快融？
 

　　凍存細胞時，細胞內(nèi)外環(huán)境中的水會形成冰晶。如果直接將細胞凍存到 -196℃ 的液氮中，由于凍結(jié)過程中胞外溶液中的水先結(jié)冰，使胞外溶液不斷濃縮，引起細胞電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水及蛋白質(zhì)變性等，會導(dǎo)致細胞受到機械性損傷。
 

　　2、細胞凍存-讓你細胞安心沉睡
 

　　3、細胞復(fù)蘇-讓細胞滿血復(fù)活
 

　　■ 細胞拿取
 

　　盡量減少樣品從液氮或 -80℃ 取出到放置在解凍裝置中之間被動升溫的時間，否則會大大影響細胞活力。如果儲存裝置和解凍裝置相隔較遠，可使用裝有干冰 (-80°C) 或液氮 (-196°C) 的隔熱容器臨時保存和運送細胞。
 

　　復(fù)蘇后第二天發(fā)現(xiàn)細胞沒有活？好不容易復(fù)蘇的細胞竟然污染了？怎么才能讓細胞滿血復(fù)活呢？繼續(xù)和小 M 一起往下看吧！■ 細胞拿取
 

　　盡量減少樣品從液氮或 -80℃ 取出到放置在解凍裝置中之間被動升溫的時間，否則會大大影響細胞活力。如果儲存裝置和解凍裝置相隔較遠，可使用裝有干冰 (-80°C) 或液氮 (-196°C) 的隔熱容器臨時保存和運送細胞。(注意：從液氮中取細胞時要佩戴護目鏡和手套，謹(jǐn)防凍傷及凍存管爆炸！)
 

　　■ 解凍方式a) 解凍細胞時需要快速升溫 (50~100℃/min) 才能最大保存細胞活力，解凍方式是 37℃ 水浴[3]。從液氮或 -80℃ 取出凍存的細胞后，稍擰松管蓋，防止解凍過程中凍存管炸裂。放入 37℃ 水浴中，持續(xù)搖晃 1-2 分鐘直至解凍。
 

　　通常建議在可見冰融化但樣品仍然冰冷(~0℃)時立即停止解凍，常見的做法是在只剩下一小片冰時從水浴鍋中取出樣品。升溫至室溫或更高溫度會增加冷凍保護劑的細胞毒性，這會極大影響細胞活力[1]。
 

　　b) 不建議室溫解凍細胞，因為這會導(dǎo)致細胞死亡。
 

　　c) 為降低污染風(fēng)險，水浴解凍時凍存管管口要高于水面，避免水流入凍存管，水浴鍋中的無菌水也要定期更換。
 

　　■ 稀釋
 

　　解凍后應(yīng)盡快稀釋，以減少 DMSO 的細胞毒性。按照培養(yǎng)基：凍存液 ≥10:1 的比例加入培養(yǎng)基進行稀釋，然后離心并更換培養(yǎng)基重懸細胞，這樣可以減少由滲透壓變化導(dǎo)致的細胞應(yīng)激。
 

　　■ 換液
 

　　依據(jù)細胞狀態(tài)，在細胞貼壁后或 24 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)。